全国服务咨询热线:

15221734409

article技术文章
首页 > 技术文章 > 分享海马神经元原代培养的详细操作步骤

分享海马神经元原代培养的详细操作步骤

发布时间:2022-12-08      点击次数:78
 海马神经元原代培养一般是将孕雌鼠麻醉然后解剖,胎儿收集到HBSS-1中然后快速断头。剥离脑膜和白质后,大脑皮质收集入HBSS-2液中机械磨碎。皮质碎片移到有0.025%胰酶的HBSS-2液中37°C消化15分钟。胰酶消化后,细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲洗两次,用神经基础培养液重悬细胞(培养液添加了0.5mM左旋-谷氨酰胺,25μM左旋-谷氨酸,2%B27和0.12mg/mL庆大霉素)。以1×105cell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上,放到37°C,5%CO2湿温培养箱里进行培养。每3天用吸管换液,一次换0.5mL。体外培养8天细胞就能用于实验。

海马神经元原代培养培养步骤(以海马为例)
1、取胚胎期第18天(E18)的孕鼠(小鼠的cellculture可取P0-P1的新生鼠,冰上麻醉),用异氟烷混合气体麻醉(注意:最好不要腹腔注射水合氯醛进行麻醉,因为腹腔注射对胎鼠影响较大);  
2、在冰上迅速破腹取出胎鼠;  
3、将胎鼠的头剪下放在冰的dissectionmedium里;  
4、剥去皮肤组织和颅骨,将大脑连接小脑一起取出放在另一个装有冰的dissectionmedium的dish中;  
5、将dish放在冰上,将大脑分割成两半,分割时在与小脑连接的腹侧基部断开,这样便于暴露海马;  
6、拨去脑膜,用小剪刀将海马剪出。由于皮层细胞较多,此时可将接近小脑的那些皮层组织夹去(注意:不要用镊子挤捏脑组织,这样会造成大面积细胞死亡,不利于后续的培养);  
7、在dish中将组织用小剪刀减碎;  
8、吸取含有组织碎块的dissectionmedium至5ul的epp管中;  
9、静置一段时间,待组织碎块沉降至底部后吸取上清(不需要吸的很干净);  
10、在另一个5ml的epp管中按照trysin:DNA酶:digestionsolution=1:1:3的体积比混合,用过滤器过滤后加入组织块中;  
11、在37度消化7-8分钟,最长不要超过15分钟(消化时间根据酶的浓度确定),每2分钟混匀一下;  
12、此时可以在5ml的epp管中准备trysininhibitor(TI):dissectionmedium=1:4的混合液(也可以用5%FBS+Neurobasal+B27代替),在预先coating的dish中加入一定量的5%FBS+Neurobasal+B27混合液;  
13、将消化的组织块从37度中取出、离心,也可自然沉降,吸取上面多余的液体后,加入第12步的混合液中止消化,37度静置2-3分钟;  
14、以下步骤要求在冰上完成。静置,待组织块沉到底或者离心后,吸走上清液,然后加入DNA酶(可用dissectionmedium稀释),吹打;  
15、离心5-6分钟,吸走上清;  
16、加入2-3ml的dissectionmedium后,用移液器或者吸管将碎组织块吹散;  
17、10倍稀释后计数(10ul悬浮液+90ul台盼蓝);  
18、按照要求浓度铺板,然后充分混匀;  
注意:一般一只小鼠的脑子可以取得2x10^7-3x10^7个神经元,体外培养3-9天的神经元均可以被慢病毒感染。
 

海马神经元原代培养

 

伊莱博生物科技(上海)有限公司
地址:上海市宝山区长江南路180号B区650室
邮箱:yilaibo@shyilaibo.com
传真:021-36199917
关注我们
欢迎您关注我们的微信公众号了解更多信息:
欢迎您关注我们的微信公众号
了解更多信息