M5C甲基化调控糖酵解在调控肝癌进展中的新机制

RNA修饰在生命过程和疾病发生发展中的作用逐渐受到重视，其中5-甲基胞嘧啶（m5C）修饰是热门研究领域。本文聚焦于m5C 甲基转移酶NSUN2在肝癌中的作用，NSUN2通过M5C修饰稳定PKM2 mRNA促进肝癌糖酵解和进展。

m5C修饰是指在RNA分子中，通过特定的酶将胞嘧啶（C）的第5位碳原子上加上一个甲基基团，形成5-甲基胞嘧啶。这种修饰不会改变RNA的基本核苷酸序列，但会在不改变遗传信息编码的基础上，赋予RNA新的化学和生物学特性。m5C修饰主要由NSUN（NOL1/NOP2/SUN）家族的甲基转移酶催化完成，涉及mRNA稳定性与翻译调控、tRNA 稳定性与解码功能、rRNA加工与核糖体功能和非编码RNA功能调节，广泛地参与到各种生命活动的调控中。

研究背景：

肝癌（HCC）是常见癌症及癌症死亡主要原因，术后转移复发致患者5年生存率低。RNA 的5-甲基胞嘧啶（m5C）修饰在多种癌症中发挥作用，NSUN2是m5C甲基转移酶，但它在肝癌中的临床意义、作用机制等尚不明确。

研究方法：

临床样本采集与分组：收集125对肝癌（HCC）及相应癌旁组织（ANL），用于RT-qPCR、western blot及IHC分析NSUN2表达分布与患者临床特征的相关性，并进行mRNA m5C斑点印迹和m5C-RIP-seq测序。

细胞实验：主要检测多株肝癌细胞株的及增殖、迁移和侵袭等细胞行为学改变。

动物实验：选用5周龄雄性BALB/c裸鼠，在其双侧腋窝皮下接种HCC细胞建立皮下异种移植模型，定期测量肿瘤体积；通过尾静脉注射HCC细胞建立肺转移模型，用活体成像系统监测转移过程。

其他：RNA免疫沉淀实验、荧光素酶报告基因实验、放线菌素D实验、代谢测量实验等；

主要研究结果：

（1）NSUN2在HCC组织中的表达上调；

通过对125对HCC和癌旁组织（ANL）的研究，运用蛋白质免疫印迹（WB）和免疫组化（IHC）分析，结果显示HCC组织中NSUN2的蛋白水平显著高于ANL组织。Kaplan-Meier 生存分析，结果显示NSUN2高表达患者的总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）明显低于NSUN2低表达患者。此外，对80例HCC患者的临床病理特征与NSUN2表达进行分析，发现NSUN2高表达与肿瘤大小、微血管侵犯（MVI）、TNM分期和BCLC分期显著相关。肿瘤越大、存在微血管侵犯、TNM分期和BCLC分期越晚，NSUN2的表达越高。

图1. HCC组织中NSUN2高表达并与HCC不良预后有关。

（2）体内外实验检测NSUN2 对HCC生长和转移的影响

运用慢病毒分别在HepG2和SNU387细胞中稳定过表达NSUN2，在Hep3B和Huh7细胞中稳定沉默NSUN2。过表达NSUN2能够促进肝癌细胞增殖和迁移，而沉默NSUN2则抑制肝癌细胞增殖和迁移。体内实验结果表明，NSUN2过表达显著促进了裸鼠皮下瘤生长并增加肝癌肺转移，而NSUN2沉默则抑制皮下瘤生长和肺转移。

图2. NSUN2在体内外诱导肝癌的生长和转移。

（3）NSUN2介导的m5C修饰在肝癌HCC中的作用

对5对HCC和癌旁正常肝组织进行m5C dot blotting，结果显示HCC组织中总mRNA m5C 水平高于ANL组织；m5C-RIP-seq分析显示HCC和癌旁正常肝组织m5C修饰存在差异，联合分析mRNA m5C-RIP-seq和 mRNA-Seq数据，发现HCC中mRNA表达与m5C水平呈轻度正相关；KEGG通路分析显示，表达和m5C水平均上调的mRNA主要富集在10条信号通路中，其中癌症中的中心碳代谢、半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢等与代谢相关。

图3. NSUN2介导的m5C高甲基化促进肝细胞癌的代谢转变。

（4）PKM2是NSUN2介导的m5C修饰的主要靶标

对Hep3B-NSUN2-sh2细胞及其阴性对照进行mRNA测序，结果显示敲低NSUN2后，236个基因上调，376个基因下调。将HCC中表达上调的mRNA、m5C 水平上调的mRNA以及 Hep3B细胞中敲低NSUN2后表达下调的mRNA进行重叠分析，通过维恩图筛选出11个符合标准的mRNA（B3GNT3、CD7、EML2、FOXC1、GDF15、LRP4、MAPT、MCTP1、PKM2、PODXL 和 SLC1A7）。检测这11个mRNA在40对HCC和癌旁正常肝组织中的表达，发现其中7个在HCC中上调。进一步检测这7个mRNA在肝癌细胞系中的表达，结果显示，在HepG2和SNU387细胞中过表达NSUN2后，只有PKM2的表达上调；在Hep3B 和Huh7细胞中沉默NSUN2后，PKM2的表达下调。此外，根据m5C-RIP-seq结果，PKM2 mRNA上调的m5C峰位于其3′ - UTR（chr15:72491753 - 72491855，hg19）。通过针对该峰的m5C-RIP-qPCR验证了这一结果，进一步表明PKM2 mRNA是NSUN2作用的主要靶标。

图4. PKM2 mRNA是NSUN2作用的靶标。

（5）NSUN2通过增加m5C水平稳定PKM2 mRNA

通过放线菌素D处理HCC细胞，并在不同时间点利用RT-qPCR分析PKM2 mRNA水平。结果显示，过表达NSUN2会减缓PKM2 mRNA的降解，而沉默NSUN2则加速其降解。m5C-RIP-qPCR发现SNU387细胞中过表达NSUN2后，PKM2 mRNA m5C水平升高；在 Hep3B细胞中沉默NSUN2后，其m5C水平降低；随后，使用针对PKM2的m5C峰的引物和经亚硫酸氢盐转化RNA逆转录的cDNA模板进行亚硫酸氢盐PCR，然后进行Sanger测序，发现在chr15:72491773（hg19）位点（C773）的信号中，既有胞嘧啶（‘C’）又有胸腺嘧啶（‘T’），这表明该位点在HCC组织和细胞系中均发生了m5C 甲基化。通过计算各样本中C773位点的m5C水平，发现HCC组织中的m5C水平高于癌旁正常肝组织。同时，SNU387细胞过表达 NSUN2后该位点m5C水平上升，Hep3B细胞沉默NSUN2后该位点m5C水平则下降。最后，构建含有野生型3′-UTR的PKM2 mRNA（PKM2-WT）和突变型 C773（PKM2-Mut）的质粒进行荧光素酶报告基因实验。结果表明，过表达NSUN2可增加 PKM2-WT的荧光素酶活性，对PKM2-Mut则无此作用；沉默NSUN2的效果则相反表明 NSUN2 对PKM2的调控作用依赖于m5C位点C773。

图5. NSUN2通过增加m5C水平稳定PKM2 mRNA。

（6）NSUN2通过上调PKM2促进HCC的糖酵解和进展

通过检测过表达和敲低NSUN2后HCC细胞的葡萄糖摄取、乳酸生成、细胞外酸化率（ECAR）和糖酵解质子外流率（glycoPER）来评估糖代谢变化。发现过表达NSUN2显著增加了葡萄糖摄取、乳酸生成、ECAR和glycoPER，敲低NSUN2则降低了这些指标，表明 NSUN2 促进HCC细胞的糖酵解。

图6. NSUN2通过上调PKM2促进HCC的糖酵解和进展。

随后，使用siRNA靶向PKM2，发现其可下调PKM2四聚体、二聚体和单体的表达，而过表达NSUN2可减缓这种下调作用。敲低PKM2抑制了葡萄糖摄取、乳酸生成、ECAR和glycoPER，而过表达NSUN2可部分阻断这些抑制作用，表明NSUN2 对HCC糖酵解的促进作用部分通过上调PKM2实现。最后，检测了PKM2对HCC细胞生长和侵袭的影响及NSUN2的作用，发现敲低PKM2抑制了HCC细胞的生长和侵袭，而过表达NSUN2可阻断这种抑制作用，说明NSUN2通过上调PKM2促进HCC细胞的生长和侵袭。

（7）研究示意图

直观地展示从NSUN2表达上调，到PKM2 mRNA稳定、PKM2蛋白增加，再到促进HCC糖酵解、细胞增殖和迁移的一系列过程，为理解HCC的发病机制提供了重要的理论依据，也为后续研究潜在的治疗靶点提供了方向。

图7. NSUN2介导PKM2在HCC中的m5C调节机制示意图。

研究总结：

肝癌中NSUN2表达上调且与预后不良相关；NSUN2通过增加PKM2 mRNA的m5C修饰稳定其表达，促进糖酵解，进而推动肝癌进展，研究明确PKM2是NSUN2介导m5C修饰的靶基因，揭示NSUN2促进肝癌进展的关键机制。综合多种实验方法，从细胞、动物模型及临床样本验证，NSUN2可作肝癌预后指标和治疗靶点，为肝癌临床诊疗提供新思路。

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参考文献

Qi Q, Zhong R, Huang Y, Tang Y, Zhang XW, Liu C, Gao CF, Zhou L, Yu J, Wu LY. The RNA M5C methyltransferase NSUN2 promotes progression of hepatocellular carcinoma by enhancing PKM2-mediated glycolysis. Cell Death Dis. 2025 Feb 9;16(1):82. doi: 10.1038/s41419-025-07414-5. PMID: 39924557; PMCID: PMC11808121.