脊髓神经元原代培养的技术操作流程如下

　　脊髓神经元原代培养是一种从动物胚胎或新生个体的脊髓组织中分离并体外培养具有功能活性的神经元细胞的技术。该技术广泛应用于神经发育、神经退行性疾病（如肌萎s侧索硬化症ALS、脊髓损伤修复）、突触可塑性、神经药理学及神经毒性研究等领域。由于脊髓神经元为终末分化细胞，因此原代培养是研究其生理与病理机制的重要手段。

　　脊髓神经元原代培养的技术操作流程：

　　1、组织分离与解剖

　　在冰浴HBSS中快速取出胚胎或新生鼠的脊柱。

　　在显微镜下沿脊柱背侧切开，小心剥离脑膜和周围结缔组织。

　　取出脊髓，置于冰预冷新鲜HBSS中漂洗2–3次，去除血膜和残余组织。

　　2、组织消化

　　将脊髓组织剪碎成约1 mm³小块。

　　加入预热的胰蛋白酶溶液（37°C），消化15–25分钟。

　　消化期间可轻柔吹打或振荡以助解离。

　　3、终止消化与细胞悬液制备

　　加入含血清的培养基终止消化。

　　用移液管轻柔吹打组织块10–15次，使细胞充分分散。

　　通过200目细胞筛网过滤，去除未消化的组织团块。

　　离心（1000 rpm，5分钟），弃上清。

　　4、细胞重悬与计数

　　用完q培养基（Neurobasal+B27+L-谷氨酰胺等）重悬细胞沉淀。

　　台盼蓝染色法进行活细胞计数，确保活率>90%。

　　5、接种与培养

　　将细胞接种于预先包被PDL或PDL/Laminin的培养皿或盖玻片上。

　　接种密度：1–5×10⁵cells/cm²（依实验目的调整）。

　　培养条件：37°C、5%CO₂、饱和湿度。

　　2–4小时后，可更换一次培养基，去除未贴壁的死细胞和碎片。

　　6、维持培养

　　每3–4天更换一半培养基（避免完q换液导致神经元脱落）。

　　可添加抗有丝分裂剂（如阿糖胞苷Ara-C,1–5μM）在培养第2–3天加入，抑制非神经元细胞（如胶质细胞）过度增殖。

　　培养周期：一般可维持14–21天，期间神经元可形成轴突、树突和突触连接。