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样本处理
需取大鼠心脏组织,去除周围血管和结缔组织,经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋或OCT包埋冷冻切片58
新生大鼠心脏需用D-Hanks液冲洗残留血细胞,组织块消化采用0.08%蛋白酶分次消化4
主要试剂与仪器
一抗(如心钠素抗体、Col Ⅰ/Ⅲ抗体)、二抗、DAB显色试剂
需准备CO₂培养箱、倒置显微镜、离心机等设备
切片制备
石蜡切片厚度建议5μm,需经脱蜡、水化及抗原修复处理
冷冻切片需避免反复冻融,厚度通常为8-10μm
免疫染色
阻断内源性过氧化物酶(3% H₂O₂)
血清封闭后滴加一抗(4℃过夜)
二抗孵育及DAB显色
采用ABC法或PAP法,步骤包括:
荧光染色需避光操作,常用荧光二抗标记
对照设置
需设阴性对照(PBS替代一抗)和阳性对照(已知阳性组织)
显微镜观察
心钠素阳性颗粒主要分布于心房肌细胞胞质,右心耳表达
胶原纤维(Col Ⅰ/Ⅲ)可通过Masson染色辅助评估纤维化程度
图像处理
使用图像分析软件定量阳性信号面积或光密度值
组织固定时间不超过24小时,避免抗原丢失
蛋白酶消化新生心肌细胞时需严格控制时间(第一次8分钟,后续2分钟/次)
力竭运动模型可能影响心钠素表达,需规范动物分组
如需特定蛋白(如P物质、心房肽)的检测方法,可进一步结合荧光染色或乙醛酸诱发荧光法
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