细胞增殖-MTT法实验

实验原理

MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)是一种黄色水溶性化合物，可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为蓝紫色不溶性甲臜(Formazan)结晶2。甲臜结晶量与活细胞数量成正比，通过DMSO溶解后可用酶标仪测定吸光度值，间接反映细胞增殖状态。

实验材料

• ‌细胞样本‌：对数生长期细胞(推荐70-80%融合度)
  

• ‌主要试剂‌：

• MTT溶液(5mg/mL，PBS配制)
  

• DMSO(分析纯)
  

• 培养基(含10%胎牛血清)
  

• ‌仪器设备‌：

• 96孔细胞培养板
  

• CO₂培养箱
  

• 酶标仪(检测波长490nm)
  

实验步骤

细胞接种

1. 消化收集对数期细胞，血球计数板计数
   

2. 96孔板每孔接种100μL细胞悬液(密度1×10³-1×10⁴个/孔)
   

3. 边缘孔用无菌PBS填充减少蒸发干扰
   

药物处理

1. 细胞贴壁后(通常24小时)，加入不同浓度待测药物
   

2. 每个浓度设3-5个复孔
   

3. 37℃、5% CO₂继续培养12-48小时
   

MTT染色

1. 每孔加入10μL MTT溶液(终浓度0.5mg/mL)
   

2. 继续培养4小时
   

3. 小心吸弃上清(悬浮细胞需先离心)
   

甲臜溶解

1. 每孔加入100-150μL DMSO
   

2. 低速振荡10分钟使结晶充分溶解
   

检测分析

1. 酶标仪490nm波长测定各孔OD值
   

2. 计算抑制率：[(对照组OD-实验组OD)/对照组OD]×100%
   

关键参数优化

• ‌细胞接种数‌：根据增殖速度调整(快速增殖细胞可减少至1×10³个/孔)
  

• ‌MTT反应时间‌：2-4小时(时间过长易产生毒性)

• ‌检测范围‌：OD值控制在0-0.7之间保证线性关系

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