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干细胞成球实验(sphere-formation assay)是一种基于非贴壁依赖培养条件的干细胞筛选技术
。在无血清但富含特定细胞因子的培养环境中,具有干性的细胞能够聚集成团形成三维球体结构,而普通分化细胞则因缺乏贴壁条件而凋亡
。这种球体结构能模拟体内干细胞微环境,是评估细胞自我更新能力的金标准。
细胞样本:对数生长期干细胞(推荐60-80%融合度)
特殊耗材:
超低吸附培养板(6/12/24孔)
细胞筛(70μm孔径)
培养基组分:
基础培养基(DMEM/F12或1640)
B27营养液(50X)
重组生长因子(EGF 10ng/mL, bFGF 10ng/mL)
胰岛素(5μg/mL)
消化收集细胞,PBS清洗2次去除血清
细胞计数后,以1000个细胞/孔密度接种于超低吸附6孔板
加入无血清成球培养基(含EGF+bFGF)
37℃、5% CO₂培养7-10天
70μm细胞筛过滤收集原代球体
消化成单细胞悬液,PBS重悬
按相同条件进行二次培养
计算球体形成效率(SFE)=球体数/接种细胞数×100%
接种密度:500-2000个细胞/孔(密度过高易导致球体融合)
培养周期:7-14天(定期镜下观察球体形态)
鉴定标准:
直径>50μm的球体计为有效克隆
连续传代3次仍保持成球能力
肿瘤干细胞研究:富集CD44+/CD133+肿瘤起始细胞
药物筛选:评估靶向干细胞药物的效果
衰老研究:检测脂肪祖细胞(APCs)的年龄相关活化
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