细胞增殖-干细胞成球实验

实验原理

干细胞成球实验(sphere-formation assay)是一种基于非贴壁依赖培养条件的干细胞筛选技术
。在无血清但富含特定细胞因子的培养环境中，具有干性的细胞能够聚集成团形成三维球体结构，而普通分化细胞则因缺乏贴壁条件而凋亡
。这种球体结构能模拟体内干细胞微环境，是评估细胞自我更新能力的金标准。

实验材料

• ‌细胞样本‌：对数生长期干细胞(推荐60-80%融合度)
  

• ‌特殊耗材‌：

• 超低吸附培养板(6/12/24孔)
  

• 细胞筛(70μm孔径)
  

• ‌培养基组分‌：

• 基础培养基(DMEM/F12或1640)
  

• B27营养液(50X)
  

• 重组生长因子(EGF 10ng/mL, bFGF 10ng/mL)
  

• 胰岛素(5μg/mL)
  

实验步骤

一次成球培养

1. 消化收集细胞，PBS清洗2次去除血清
   

2. 细胞计数后，以1000个细胞/孔密度接种于超低吸附6孔板
   

3. 加入无血清成球培养基(含EGF+bFGF)
   

4. 37℃、5% CO₂培养7-10天
   

二次成球验证

1. 70μm细胞筛过滤收集原代球体
   

2. 消化成单细胞悬液，PBS重悬
   

3. 按相同条件进行二次培养
   

4. 计算球体形成效率(SFE)=球体数/接种细胞数×100%
   

关键参数

• ‌接种密度‌：500-2000个细胞/孔(密度过高易导致球体融合)
  

• ‌培养周期‌：7-14天(定期镜下观察球体形态)
  

• ‌鉴定标准‌：

• 直径>50μm的球体计为有效克隆
  

• 连续传代3次仍保持成球能力
  

应用领域

• ‌肿瘤干细胞研究‌：富集CD44+/CD133+肿瘤起始细胞
  

• ‌药物筛选‌：评估靶向干细胞药物的效果
  

• ‌衰老研究‌：检测脂肪祖细胞(APCs)的年龄相关活化

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