肿瘤组织免疫荧光实验服务

普通兔疫荧光(单标)
1.切片脱蜡:将石蜡切片依次放入二甲苯I ( 10min)-二甲苯I ( 10min) -无水Z醇I ( 5min) -无水乙醇I ( 5min ) -95%酒精( 3min ) -90%酒精( 3min ) -80%酒精( 2min ) -70%酒精( 2min ) , 然后蒸馏水浸洗2min.
2、抗原修复:我们采用微波进行抗原修复，将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯(或修复盒)中的不锈钢(或耐高温塑料)切片架上,加适量的修复液( 0.01M枸橼酸缓冲液, pH6.0 )于烧杯中,液面要浸过切片组织一定高度,微波炉可先用高档加热使液体沸腾,当加热至沸腾时调到中档,此时开始计时,修复时间为10-15min ,此过程中勿使组织干片(修复液要足量)。到时间后将烧杯从微波炉中取出,放入冷水中冷却降温,当修复液降至室温后取出玻片,用PBS ( PH7.4)冲洗3遍,每次3min (冲洗过程中切勿对着组织冲洗,以免弄破组织)。
3、血清封闭:用吸水纸擦干玻片,免疫组画笔在组织周围画器,滴加稀释好的正常山羊血清，室温封闭30min ,以减少非特异性染色。
4.加一抗:甩去多余液体,不洗,然后滴加稀释好的一抗,如果做阴性对照实验。就在对照组的切片上滴加PBS。加完一抗后于4°C湿盒中孵育过夜。
5.加荧光二抗: PBST冲洗切片3次,每次3min ,吸水纸擦干切片后滴加稀释好的荧光=抗,湿盒中20-37°C孵育1h，PBST冲洗切片4次，每次3min.
注意:此步骤及后面所有操作步骤都尽量在暗处进行。
6、复染核:滴加DAPI避光孵育5min。对标本进行染核。PBST 5minx4次洗去多余的DAPI。
7.封片镜检:用吸水纸擦干切片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光显微镜下观察采集图像。