原代滑膜成纤维细胞培养实验

一、实验前准备‌

1. ‌样本来源‌

• ‌人类样本‌：关节置换术获取的滑膜组织（RA、骨关节炎或创伤患者）
  

• ‌小鼠样本‌：C57BL/6小鼠髋关节周围滑膜组织
  

2. ‌试剂与耗材‌

• 消化酶：0.5% IV型胶原酶（人类）或Pancreatin‌（小鼠）
  

• 培养基：DMEM/F12 + 10% FBS + 1%双抗
  

• 器械：眼科剪、镊子、200目细胞筛、15ml离心管
  

‌二、组织处理与消化‌

1. ‌组织清洗‌

• 人类样本：PBS冲洗去除血液，剔除脂肪及坏死组织
  

• 小鼠样本：75%乙醇浸泡5分钟后剥离滑膜
  

2. ‌消化方法‌

• 剪碎组织后加入0.5% IV型胶原酶，37℃振荡消化60分钟（人类）
  

• 小鼠滑膜需额外涡轮振荡1.5分钟以提高细胞释放率
  

• ‌酶消化法‌：

• ‌组织块法‌：将1mm³组织块直接贴壁培养，48小时后补充培养基

‌三、细胞培养与纯化‌

1. ‌初次培养‌

• 消化产物经100μm滤网过滤，离心（1000rpm, 5分钟）后重悬接种

• 培养条件：37℃、5% CO₂，换液时间为接种后3小时（去除未贴壁细胞）

2. ‌差速贴壁纯化‌

• 传代时采用Pancreatin‌短时消化（30秒-1分钟），优先收集成纤维细胞（巨噬细胞残留较少）

• 通过3次传代（15-20天）可去除99%的滑膜巨噬细胞

‌四、鉴定与质量控制‌

1. ‌形态学鉴定‌

• 原代SFs呈梭形，核椭圆形，贴壁生长

• 混杂的圆形巨噬细胞随传代逐渐消失

2. ‌免疫标记‌

• Vimentin阳性（＞98%）、CD68阴性（流式或免疫荧光）

‌五、注意事项‌

• ‌污染控制‌：滑膜组织含血管丰富，需加强双抗处理

• ‌消化优化‌：胶原酶浓度过高（＞1%）可能导致细胞活性下降

• ‌培养基选择‌：含20% FBS可促进初期贴壁，但需逐步降至10%以避免过度增殖

‌六、应用方向‌

• ‌RA研究‌：通过SFs侵袭实验模拟滑膜炎病理过程
  

• ‌药物筛选‌：测试抗纤维化或抗炎药物对SFs活性的影响