骨髓间充质干细胞原代培养实验

一、实验前准备‌

1. ‌试剂与耗材‌

• 基础培养基：α-MEM或DMEM-LG（含10%胎牛血清、1%双抗）
  

• 分离液：Percoll密度梯度液（1.073 g/ml）或直接使用全骨髓贴壁法
  

• 器械：眼科剪、镊子、1ml注射器（4.5号针头）、200目细胞筛
  

2. ‌动物处理‌

• 选择4-6周龄BALB/c小鼠或SD大鼠，脱臼处死后75%酒精浸泡5分钟
  

‌二、骨髓细胞提取‌

1. ‌骨髓冲洗‌

• 剥离股骨/胫骨，剔除肌肉组织，用注射器（含培养基）冲洗骨髓至离心管
  

• 关键点：需强力冲洗3-5次以提高细胞得率（单鼠可得约7×10⁷个细胞）
  

2. ‌细胞分离（二选一）‌

• ‌密度梯度法‌：骨髓悬液叠加Percoll液，2500rpm离心25分钟，吸取白膜层
  

• ‌全骨髓法‌：直接过滤后接种，48小时后换液去除未贴壁细胞
  

‌三、原代培养‌

1. ‌接种参数‌

• 密度：1×10⁶ cells/ml（T25培养瓶）或2.5×10⁷ cells/ml（培养皿）
  

• 条件：37℃、5% CO₂，第一次换液时间为接种后3小时（去除红细胞）
  

2. ‌后续处理‌

• 每2-3天换液，7-10天可见梭形贴壁细胞（纯度约60-70%）
  

• 传代：80%融合时用0.25%Pancreatin‌消化，传代比例1:2
  

‌四、注意事项‌

• ‌污染控制‌：超净台紫外灭菌30分钟，操作中频繁火焰消毒器械
  

• ‌形态鉴别‌：原代BMSCs呈纺锤形，混杂造血干细胞呈圆形（需通过换液逐步去除）
  

• ‌血清选择‌：建议使用批次验证的胎牛血清（浓度可提升至15%促进初期贴壁）
  

‌五、应用场景‌

• ‌分化研究‌：成骨/成脂诱导培养需从P1代开始
  

• ‌临床潜力‌：用于软骨修复或神经再生治疗

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