脂肪干细胞(ADSCs)原代培养实验指南

脂肪干细胞(Adipose-derived Stem Cells, ADSCs)是来源于脂肪组织的间充质干细胞，具有多向分化潜能
。以下是脂肪干细胞原代培养的标准操作流程：

一、实验前准备

材料与试剂

• ‌实验动物‌：4周龄雄性Wistar/SD大鼠或C57BL/6小鼠

• ‌基础试剂‌：

• PBS缓冲液(不含Ca²⁺/Mg²⁺)

• 0.075%-0.1%Ⅰ/Ⅱ型胶原酶消化液

• DMEM/F12或低糖DMEM培养基

• 10%胎牛血清(FBS)

  
  

仪器设备

• 超净工作台

• CO₂培养箱(37℃,5%CO₂)

• 离心机

• 200目尼龙筛网

二、操作流程

1. 取材与处理

• 处死动物后，75%酒精浸泡消毒2-3分钟

• 无菌条件下取腹股沟/附睾周围脂肪垫

• PBS冲洗3次去除血液和杂质

• 眼科剪剪碎至1-2mm³大小

2. 消化分离

• 加入5ml 0.1%胶原酶(37℃消化30-40分钟)

• 每5分钟震荡一次

• 或使用恒温水浴振荡器

• 加入等体积含血清培养基终止消化

• 200目筛网过滤去除未消化组织

• 1200g离心10分钟

• 弃上层脂肪和上清

• 沉淀为基质血管成分(SVF)

3. 细胞接种

• 用培养基重悬细胞

• 按1×10⁴-5×10⁴个/cm²密度接种

• 37℃、5%CO₂培养箱静置培养

三、培养维持

换液与观察

• 24小时后换液去除未贴壁细胞

• 之后每2-3天换液一次

• 倒置显微镜观察：

• 初期可见梭形/多角形细胞

• 3-5天形成克隆样集落

传代培养

• 80%汇合时传代

• 0.25%蛋白酶+0.02%EDTA消化3分钟

• 按1:2比例分瓶

四、注意事项

1. ‌无菌操作‌：全程在超净台内完成

2. ‌消化控制‌：过度消化会导致细胞损伤

3. ‌污染预防‌：培养基添加双抗

4. ‌细胞鉴定‌：传代后检测CD29/CD44等表面标志物

5. ‌分化潜能‌：3代内细胞保持最佳分化能力

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