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树突状细胞原代培养实验

简要描述:树突状细胞原代培养实验是伊莱博生物的基础服务项目之一,由经验丰富的实验人员操作完成。

  • 更新时间:2025-05-20
  • 厂商性质:代理商
  • 访  问  量:1124

详细介绍

品牌其他品牌应用领域医疗卫生,生物产业

一、实验前准备

材料与试剂

  • 实验动物‌:6-12周龄C57BL/6小鼠(推荐雌性)68

  • 基础培养基‌:RPMI-1640(含10%FBS、2mM L-谷氨酰an、1%双抗)38

  • 关键细胞因子‌:

    • GM-CSF(20ng/ml)68

    • IL-4(10ng/ml,用于外周血DC培养)5

  • 其他试剂‌:

    • 红细胞裂解液(Tris-NH4Cl)3

    • 0.125%蛋白酶(用于组织消化)4

    • Percoll分离液(用于外周血DC分离)5

二、骨髓来源DC(BMDC)培养流程36

1. 骨髓细胞获取

  • 颈椎脱臼法处死小鼠,75%酒精浸泡消毒5分钟38

  • 无菌条件下取出股骨和胫骨3

  • 用1ml注射器冲洗骨髓腔至培养基变浑浊3

  • 1000rpm离心5分钟收集细胞3

2. 红细胞裂解

  • 加入2ml Tris-NH4Cl裂解液,静置1分钟

  • 加入15ml培养基终止反应,离心弃上清

3. 细胞培养

  • 按5×10⁵/ml密度接种于未TC处理的培养瓶

  • 添加GM-CSF(20ng/ml)和β-巯基乙醇(50μM)

  • 37℃、5%CO₂培养,每2-3天半量换液

三、外周血DC培养流程

1. 单个核细胞分离

  • 肝素抗凝血经Ficoll密度梯度离心

  • 收集单个核细胞层,PBS洗涤2-3次

2. 贴壁筛选

  • 37℃贴壁3小时,去除悬浮细胞

  • 继续培养过夜(12-18小时)

3. DC富集

  • E花环形成法结合Percoll离心

  • 抗人IgG亲和吸附(Panning)进一步纯化

四、培养观察与鉴定

形态特征

  • 初期:圆形或椭圆形

  • 成熟期:典型树突状突起

表型鉴定(流式检测)8

  • 标志物:CD11c、MHC-II、CD80、CD86、CD40

  • 纯度要求:CD11c阳性率>90%

五、注意事项

  1. 无菌操作‌:全程超净台内完成

  2. 细胞因子浓度‌:GM-CSF浓度影响DC产量

  3. 成熟诱导‌:可添加LPS或TNF-α促进成熟

  4. 功能检测‌:混合淋巴细胞反应(MLR)验证抗原提呈能力

  5. 应用时机‌:培养7-10天为最佳使用期





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