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实验动物:6-12周龄C57BL/6小鼠(推荐雌性)68
基础培养基:RPMI-1640(含10%FBS、2mM L-谷氨酰an、1%双抗)38
关键细胞因子:
GM-CSF(20ng/ml)68
IL-4(10ng/ml,用于外周血DC培养)5
其他试剂:
红细胞裂解液(Tris-NH4Cl)3
0.125%蛋白酶(用于组织消化)4
Percoll分离液(用于外周血DC分离)5
颈椎脱臼法处死小鼠,75%酒精浸泡消毒5分钟38
无菌条件下取出股骨和胫骨3
用1ml注射器冲洗骨髓腔至培养基变浑浊3
1000rpm离心5分钟收集细胞3
加入2ml Tris-NH4Cl裂解液,静置1分钟
加入15ml培养基终止反应,离心弃上清
按5×10⁵/ml密度接种于未TC处理的培养瓶
添加GM-CSF(20ng/ml)和β-巯基乙醇(50μM)
37℃、5%CO₂培养,每2-3天半量换液
肝素抗凝血经Ficoll密度梯度离心
收集单个核细胞层,PBS洗涤2-3次
37℃贴壁3小时,去除悬浮细胞
继续培养过夜(12-18小时)
E花环形成法结合Percoll离心
抗人IgG亲和吸附(Panning)进一步纯化
初期:圆形或椭圆形
成熟期:典型树突状突起
标志物:CD11c、MHC-II、CD80、CD86、CD40
纯度要求:CD11c阳性率>90%
无菌操作:全程超净台内完成
细胞因子浓度:GM-CSF浓度影响DC产量
成熟诱导:可添加LPS或TNF-α促进成熟
功能检测:混合淋巴细胞反应(MLR)验证抗原提呈能力
应用时机:培养7-10天为最佳使用期
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