树突状细胞原代培养实验

一、实验前准备

材料与试剂

• ‌实验动物‌：6-12周龄C57BL/6小鼠(推荐雌性)68

• ‌基础培养基‌：RPMI-1640(含10%FBS、2mM L-谷氨酰an、1%双抗)38

• ‌关键细胞因子‌：

• GM-CSF(20ng/ml)68

• IL-4(10ng/ml，用于外周血DC培养)5

• ‌其他试剂‌：

• 红细胞裂解液(Tris-NH4Cl)3

• 0.125%蛋白酶(用于组织消化)4

• Percoll分离液(用于外周血DC分离)5

二、骨髓来源DC(BMDC)培养流程36

1. 骨髓细胞获取

• 颈椎脱臼法处死小鼠，75%酒精浸泡消毒5分钟38

• 无菌条件下取出股骨和胫骨3

• 用1ml注射器冲洗骨髓腔至培养基变浑浊3

• 1000rpm离心5分钟收集细胞3

2. 红细胞裂解

• 加入2ml Tris-NH4Cl裂解液，静置1分钟

• 加入15ml培养基终止反应，离心弃上清

3. 细胞培养

• 按5×10⁵/ml密度接种于未TC处理的培养瓶

• 添加GM-CSF(20ng/ml)和β-巯基乙醇(50μM)

• 37℃、5%CO₂培养，每2-3天半量换液

三、外周血DC培养流程

1. 单个核细胞分离

• 肝素抗凝血经Ficoll密度梯度离心

• 收集单个核细胞层，PBS洗涤2-3次

2. 贴壁筛选

• 37℃贴壁3小时，去除悬浮细胞

• 继续培养过夜(12-18小时)

3. DC富集

• E花环形成法结合Percoll离心

• 抗人IgG亲和吸附(Panning)进一步纯化

四、培养观察与鉴定

形态特征

• 初期：圆形或椭圆形

• 成熟期：典型树突状突起

表型鉴定(流式检测)8

• 标志物：CD11c、MHC-II、CD80、CD86、CD40

• 纯度要求：CD11c阳性率>90%

五、注意事项

1. ‌无菌操作‌：全程超净台内完成

2. ‌细胞因子浓度‌：GM-CSF浓度影响DC产量

3. ‌成熟诱导‌：可添加LPS或TNF-α促进成熟

4. ‌功能检测‌：混合淋巴细胞反应(MLR)验证抗原提呈能力

5. ‌应用时机‌：培养7-10天为最佳使用期