细胞周期检测技术

细胞周期检测技术实验步骤

实验共分以下4个主要步骤:

1.细胞铺盘

HeLa S3细胞，密度为80%左右分盘，使铺盘密度在50%左右，为满足流式细胞仪上机要求，细胞数目需大于1x10°/组。

2.细胞同步化处理:

a)加入终浓度2mM的Thymidine同步化18h

b) 用温育的PBS洗4次，更换新鲜培养基，培养9h

c) 再加入2mM Thymidine再次同步化18h后

3.样品收集 ;

a) 分别收取释放2h(S期)，6h(G2/M期)和12h(G1期)细胞样品

b) 每个样品收取都使用预冷的PBS洗涤4次，1000g离心5min，弃上清

c) 100uL PBS重悬沉淀，吸取出细胞悬液于移液器中，于移去细胞的管中加入900uL预冷的70%乙醇，漩涡振荡器震荡中滴

入细胞悬液。

d)4℃固定一小时或更长时间。

e)1500rmp，离心10min，去固定液。

f)细胞染色液配制:50xRNaseA母液:50xPI母液:PBS=20:20:960;RNaseA母液浓度1mg/mL，工作浓度20ug/mL;PI母液浓度2.5mg/mL，工作浓度50ug/mL。

g) 细胞37度染色1h。根据细胞量，加入一定体积的细胞染色液(1~1.5mL)重悬，使上机时细胞通过率为200~350Cell/s,染色液不可过多或过少，过多则细胞密度过低上机速度严重不足，过少则导致细胞粘结。

h) 300目筛网过滤至流式管中。

4.上机检测;

流式细胞仪上机检测，计数50000个细胞。

5.同步化数据分析

细胞周期检测技术

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