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底层琼脂：起支撑作用
上层琼脂：细胞悬浮其中，无法贴壁
只有恶性程度高 / 肿瘤干细胞样的细胞能在悬浮状态下增殖形成肉眼可见的克隆。
2× 培养基（含 20% FBS）
1.2% 低熔点琼脂糖（底层）
0.7% 低熔点琼脂糖（上层）
6 孔板
1.2% 琼脂: 2× 培养基 = 1:1混合（终浓度 0.6%）
每孔加 2 mL，室温凝固
0.7% 琼脂: 2× 培养基 = 1:1混合（终浓度 0.35%）
加入细胞悬液，混匀
细胞密度：1×10³~1×10⁴ / 孔
每孔加 1~1.5 mL，室温凝固
37℃、5% CO₂ 培养 14~21 天
每 3～4 天滴加少量培养基保湿
PBS 轻洗
结晶紫或 MTT 染色
显微镜下计数直径＞50~100 μm的克隆数
克隆数越多、体积越大 → 恶性程度 / 成瘤能力越强
给药组克隆数减少 → 抑制恶性表型
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