ELISA检测实验服务

实验步骤

1. 样品准备

a. 细胞上清样品，需将培养瓶内的细胞消化离心取上清即可（如800g，5分钟）。

b. 血清样品，将全血收集至不含抗凝剂的试管内，在室温下放置1小时，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1500g离心10分钟，取黄色上清即得血清。

c. 血浆样品，将全血收集至含抗凝剂的试管内，混匀后置冰上，4℃约1500g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆。

2. 确定样品测试组、标准品和空白组组所需的微孔条数量，每个浓度做两个平行重复，从支架上取出对应数量的微孔条，剩余储存在箔袋中，密封后在4℃储存。

3. 配制对应浓度的捕获抗体溶液、检测抗体溶液、包被液、洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液、链霉亲和素-HRP（若使用试剂盒则没有此步骤或按试剂盒要求配制）。

4. 每孔加入100μL 捕获抗体溶液，用封板膜覆盖，4℃孵育过夜，过夜后舍弃舍板内溶液。

5. 每孔加入300-400μL洗涤液清洗五次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干（若使用试剂盒则没有步骤4和5）。

6. 用样品稀释液按照1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:1000, 1:2000稀释样品，以此确定样品IL-2的最佳检测浓度。

7. 配制梯度浓度的IL-2蛋白标准品，将工作浓度设置为1200pg/mL, 600pg/mL, 300pg/mL, 150pg/mL, 75pg/mL, 37.5pg/mL, 18.75pg/mL，9.38pg/mL，以此浓度来绘制标准曲线。

8. 分别将样品、标准品、样品稀释液按照100μL/孔加入相应孔中作为标测试组、标准品组、空白组。

9. 将偶联sws的抗人IL-2抗体按照50μL/孔加入所有孔中，用封板膜覆盖，室温避光孵育2小时。

10. 每孔加入300-400μL洗涤液洗板五次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。

11. 在所有孔加入100μL稀释后的链霉亲和素-HRP，用封板膜覆盖，室温避光孵育1小时。

12. 每孔加入300-400μL洗涤液洗板五次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。

13. 在所有孔中加入100μL TMB显色液。用封板膜覆盖，室温避光孵育30min。

14. 在所有孔中加入终止液50μL，混匀后立即测量A450值。

15. 计算每一组重复的标准品和样品的平均吸光度值。重复次数应在平均值的20%以内。

16. 绘制IL-2标准品标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线计算出样品的相应浓度。