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WB实验技术服务

简要描述：免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

更新时间：2026-03-20
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实验技术服务

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一、实验流程

蛋白提取（组织 / 细胞）
BCA 蛋白定量
制胶 + 上样电泳
转膜（湿转 / 半干转）
封闭
一抗孵育
二抗孵育
ECL 化学发光显影
灰度分析（ImageJ）

二、详细步骤

1. 蛋白提取

组织 / 细胞加入含蛋白酶抑制剂 + 磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解液
冰上裂解 30 min
4℃ 12000 rpm 离心 10 min，取上清

2. BCA 定量

按试剂盒做标准曲线
测 OD 值，计算蛋白浓度
统一上样量（通常 20–30 μg / 孔）
加 5×Loading buffer，煮沸 10 min 变性

3. 制胶与电泳

分离胶：8%–12%（根据分子量）
浓缩胶：5%
电泳：

浓缩胶：80 V
分离胶：120 V
至溴酚蓝跑到底

4. 转膜

常用 0.22 μm/0.45 μm PVDF 膜
甲醇活化膜 1 min
湿转：250 mA 60–90 min
半干转：15–25 min（看仪器）

5. 封闭

5% 脱脂牛奶或 BSA
室温摇床 1 h

6. 一抗孵育

按说明书稀释（1:500–1:2000 常见）
4℃ 摇床过夜
TBST 洗膜 3×10 min

7. 二抗孵育

羊抗兔 / 羊抗鼠 HRP 二抗
1:5000–1:10000 稀释
室温 1 h
TBST 洗膜 3×10 min

8. 显影

ECL 发光液 A:B 1:1 混合
均匀滴在膜上，化学发光仪成像

9. 分析

ImageJ 测灰度值
目的蛋白 / 内参（GAPDH/β-actin/Tubulin）
统计相对表达量

三、你课题常用指标（直接对应）

纤维化：α-SMA、Col1、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad3
炎症：TNF-α、IL-1β、NF-κB p65、p-p65、IκBα
凋亡：Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase3、Caspase3
氧化应激：Nrf2、HO-1、SOD1
代谢 / 糖尿病：PPARγ、PI3K、Akt、p-Akt

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一、实验流程

二、详细步骤

1. 蛋白提取

2. BCA 定量

3. 制胶与电泳

4. 转膜

5. 封闭

6. 一抗孵育

7. 二抗孵育

8. 显影

9. 分析

三、你课题常用指标（直接对应）

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