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流式ROS检测

简要描述:活性氧(ROS)的流式检测通常是通过使用荧光探针如DCFH-DA来监测细胞内活性氧水平的变化。

  • 更新时间:2024-03-14
  • 厂商性质:代理商
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详细介绍

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01选择荧光探针常用的荧光染料是DCFH-DA,它能够进入细胞并在细胞内被酯酶水解成DCFH。DCFH随后可以被细胞内的活性氧氧化,生成发荧光的DCF。

02DCFH-DA是一种用于检测活性氧ROS的荧光探针,全称为2,7-二氯荧光素二乙酸酯。其工作原理为:DCFH-DA本身没有荧光,但可以自由穿过细胞膜,一旦进入细胞,它会被细胞内的酯酶水解成DCFH,由于DCFH无法穿过细胞膜,因此荧光探针会在细胞内积聚。细胞内的ROS能够氧化无荧光的DCFH,生成有荧光的DCF,且荧光强度与ROS水平成正比。通过荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等设备,在最大激发波长480nm和最大发射波长525nm下检测荧光信号。

03步骤装载探针

对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞,先装载探针,后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞,先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞,后装载探针。

原位装载探针:本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液,加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜,通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

收集细胞后装载探针:按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中,细胞浓度为一百万至二千万/毫升,37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞,或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。


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