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泛素化实验

简要描述：‌E3连接酶筛选与验证‌

通过酵母双杂交、GST Pull-down或CRISPR筛选技术发现候选E3酶，再通过体外/体内泛素化实验验证其功能‌17。
示例：研究KRAS突变时，发现USP25与RNF31调控KRAS的线性泛素化修饰‌1。
‌泛素链类型分析‌

利用特异性泛素抗体（如K48、K63链抗体）或串联泛素结合结构域（TUBEs）区分泛素链连接方式‌36。

更新时间：2025-02-28
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‌体外泛素化实验‌

使用重组表达的E1、E2、E3酶与底物蛋白，结合ATP、泛素分子进行反应，通过Western Blot检测底物泛素化水平‌26。
常用试剂盒（如Ubiquitinylation Kit）可标准化操作流程‌7。

‌体内泛素化检测‌

在细胞中过表达泛素、E3连接酶及底物蛋白，利用蛋白酶体抑制剂（如MG132）阻断降解，通过免疫共沉淀（Co-IP）富集目标蛋白后检测泛素化信号‌26。

‌泛素化位点鉴定‌

‌质谱法‌
：通过富集泛素化肽段，结合高分辨率质谱确定具体修饰位点‌45。
‌点突变验证‌
：基于生物信息学预测（如UbiNet、GPS-Uber等工具），对潜在赖氨酸位点进行突变后观察泛素化水平变化‌47。

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