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样本固定
成骨诱导分化结束后，吸去培养基，用1×PBS轻柔洗涤细胞2~3次23。
加入4%多聚甲醛或10%福尔马林固定液，室温固定30分钟12。
洗涤与风干
去除固定液后，用蒸馏水或1×PBS冲洗3次以去除残留固定剂12。
风干载玻片或培养板，确保样本干燥34。
染色处理
加入0.1%茜素红染色液（溶于0.05M Tris-HCL缓冲液，pH8.3），37℃孵育5-30分钟（时间依钙盐含量调整）12。
染色后迅速用蒸馏水冲洗，避免染料残留导致背景过深23。
复染与观察
可选固绿染色液复染1分钟以增强背景对比度34。
显微镜下观察：钙结节呈橙红色，背景为绿色或粉红色23。
保存
染色后样本用封口膜密封，4℃保存可维持染色效果2周23。
操作轻柔
避免剧烈震荡或长时间暴露于液体中，防止钙结节脱落12。
染色条件优化
染色液使用前需恢复至室温，染色时间根据镜下钙盐沉积量动态调整（通常5-10分钟）23。
染色过深时可用1%盐酸酒精分色4。
试剂选择
推荐使用商品化茜素红S试剂（如Beyotime ST1078-5g），纯度稳定5。
固定剂优先选择中性福尔马林，避免酸性条件干扰钙盐结构24。
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