细胞增殖-Brdu流式实验

实验原理

BrdU是胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞DNA合成期(S期)可竞争性掺入新合成的DNA链。通过荧光标记的抗BrdU抗体与流式细胞术结合，可精确定量处于增殖期的细胞比例

实验材料

• ‌细胞样本‌：对数生长期细胞(推荐密度70-80%融合)
  

• ‌主要试剂‌：

• BrdU储存液(10mM，溶于PBS)
  

• 抗BrdU-FITC/Percp抗体
  

• DNA酶/盐酸处理液
  

• 7-AAD或PI染色液(用于细胞周期分析)
  

• ‌仪器设备‌：流式细胞仪、离心机、CO₂培养箱
  

实验步骤

细胞标记

1. 向培养体系加入BrdU终浓度10μM，37℃孵育30分钟至2小时
   

2. 消化收集细胞，PBS洗涤2次
   

细胞固定与透化

1. 70%冷乙醇4℃固定30分钟
   

2. 2M HCl室温处理30分钟(暴露BrdU抗原位点)
   

3. 0.1M硼酸钠缓冲液(pH8.5)中和
   

抗体染色

1. 抗BrdU一抗(1:100稀释)室温孵育1小时
   

2. PBS洗涤后加荧光二抗(避光孵育30分钟)
   

3. 可选：加入7-AAD(5μg/mL)共染DNA
   

流式检测

1. 上机前用40μm滤膜过滤
   

2. 流式细胞仪设置：

• FITC通道检测BrdU(Ex 488nm/Em 530nm)
  

• PerCP通道检测7-AAD(Ex 488nm/Em 670nm)
  

3. 采集10,000个以上细胞事件
   

数据分析

• ‌双参数分析‌：BrdU+ vs DNA含量(7-AAD)，区分G0/G1、S、G2/M期细胞
  

• ‌增殖指数计算‌：(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%
  

• ‌注意事项‌：

• 设门排除细胞碎片
  

• 同型对照设定阴性阈值
  

技术优势

• 高灵敏度：可检测<1%的增殖细胞
  

• 多参数分析：结合细胞周期和表型标记
  

• 动态追踪：通过脉冲-追踪实验研究增殖动力学
  

常见问题解决

• ‌背景高‌：延长封闭时间，优化抗体浓度
  

• ‌信号弱‌：增加BrdU孵育时间至4小时
  

• ‌细胞聚集‌：减少固定时间，增加DNA酶处理