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BrdU是胸腺嘧啶核苷类似物,在细胞DNA合成期(S期)可竞争性掺入新合成的DNA链。通过荧光标记的抗BrdU抗体与流式细胞术结合,可精确定量处于增殖期的细胞比例
细胞样本:对数生长期细胞(推荐密度70-80%融合)
主要试剂:
BrdU储存液(10mM,溶于PBS)
抗BrdU-FITC/Percp抗体
DNA酶/盐酸处理液
7-AAD或PI染色液(用于细胞周期分析)
仪器设备:流式细胞仪、离心机、CO₂培养箱
向培养体系加入BrdU终浓度10μM,37℃孵育30分钟至2小时
消化收集细胞,PBS洗涤2次
70%冷乙醇4℃固定30分钟
2M HCl室温处理30分钟(暴露BrdU抗原位点)
0.1M硼酸钠缓冲液(pH8.5)中和
抗BrdU一抗(1:100稀释)室温孵育1小时
PBS洗涤后加荧光二抗(避光孵育30分钟)
可选:加入7-AAD(5μg/mL)共染DNA
上机前用40μm滤膜过滤
流式细胞仪设置:
FITC通道检测BrdU(Ex 488nm/Em 530nm)
PerCP通道检测7-AAD(Ex 488nm/Em 670nm)
采集10,000个以上细胞事件
双参数分析:BrdU+ vs DNA含量(7-AAD),区分G0/G1、S、G2/M期细胞
增殖指数计算:(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%
注意事项:
设门排除细胞碎片
同型对照设定阴性阈值
高灵敏度:可检测<1%的增殖细胞
多参数分析:结合细胞周期和表型标记
动态追踪:通过脉冲-追踪实验研究增殖动力学
背景高:延长封闭时间,优化抗体浓度
信号弱:增加BrdU孵育时间至4小时
细胞聚集:减少固定时间,增加DNA酶处理
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