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透射电子显微镜(TEM)利用高能电子束穿透超薄样品,通过电磁透镜成像系统放大观察细胞超微结构
。其分辨率可达0.1-0.2nm,能清晰显示细胞膜、细胞器、染色质等亚显微结构
。
细胞固定:
2.5%戊二醛(0.1M PBS配制)4℃初固定2-4小时
1%锇酸后固定1-2小时(需避光操作)
脱水处理
梯度乙醇(50%-100%)逐级脱水
环氧丙烷作为中间过渡溶剂
包埋剂配制:
环氧树脂Epon812与硬化剂DDSA、MNA按比例混合
包埋程序:
树脂渗透:环氧丙烷与树脂1:1混合浸透2小时
纯树脂包埋:60℃聚合48小时
超薄切片:
切片厚度控制在60-80nm(灰色干涉色)
使用钻石刀切取,铜网收集切片
醋酸铀染色:
2%醋酸铀乙醇溶液染30分钟
柠檬酸铅染色:
Reynold's柠檬酸铅染5-10分钟
注意避免二氧化碳污染
细胞膜系统:观察质膜完整性、线粒体脊结构
细胞核:染色质分布状态、核膜连续性
特殊结构:
干细胞伪足形态(胚胎样干细胞可见花多样伪足)
铁死亡细胞特征(线粒体缩小、膜密度增加)
样品质量:
避免人工假象(如冰晶损伤、收缩裂隙)
凋亡细胞需与坏死细胞鉴别(染色质边集vs均匀肿胀)
操作规范:
锇酸废液需专用容器收集
铅染色需在NaOH干燥环境中进行
设备参数:
加速电压通常设置80-120kV
使用CCD相机记录图像(避免长时间电子束照射)
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