外泌体示踪

一、主流示踪方法（原理 + 适用 + 操作要点）

1. 亲脂性荧光染料标记（常用、易操作）

• 染料：PKH26（红）、PKH67（绿）、DiI、DiD、DiR（近红外，适合活体）

• 原理：插入外泌体脂质双层膜，荧光稳定、不影响膜结构

• 适用：体外细胞摄取、活体成像（DiR）、共聚焦 / 荧光显微镜

• 标准流程（DiD 为例）

1. 纯化外泌体（超速离心 / 试剂盒），BCA 定量（100 μg 蛋白）

2. 加 DiD 母液至终浓度5 μM，37℃避光震荡（200 rpm）孵育4 h

3. 超速离心（120,000×g，4℃，90 min）去游离染料，PBS 重悬

4. 过 PD-10 脱盐柱纯化，检测粒径（PDI<0.2）与回收率（≥80%）

• 关键对照：染料 - only 对照（排除游离染料干扰）

2. 遗传工程标记（稳定、可靠）

• 方法：构建CD63-GFP/CD9-mCherry等外泌体标志物融合质粒，慢病毒 / 质粒转染供体细胞，细胞分泌带荧光的外泌体

• 原理：荧光蛋白与外泌体膜蛋白共表达，信号稳定、无染料毒性

• 适用：示踪、体内分布、机制研究（无染料干扰）

• 操作：转染→筛选稳转株→收集上清→提取外泌体→直接示踪

• 优势：100% 标记、无游离信号、结果可信

3. 胞内酶切标记（间接示踪）

• 染料：CFSE、Calcein-AM

• 原理：标记供体细胞，细胞分泌外泌体时携带荧光，间接示踪

• 适用：快速筛选、初步验证，不适合定量

4. 其他示踪（进阶）

• 核酸标记：荧光 siRNA/miRNA 载入外泌体，追踪核酸递送

• 磁性标记（SPIO）：超顺磁性氧化铁标记，MRI/MPI 活体深层成像

• 放射性标记（⁸⁹Zr/⁹⁹ᵐTc）：PET/SPECT 定量体内分布、药代动力学

二、标准实验流程（体外 + 体内）

（一）体外细胞摄取实验（共聚焦 / 流式）

1. 外泌体标记：选 PKH26/DiD/CD63-GFP，纯化去游离染料

2. 细胞铺板：共聚焦皿 / 6 孔板，密度 5×10⁴ cells/cm²，贴壁 16 h

3. 孵育：无血清培养基稀释标记外泌体（10–200 μg/mL），37℃孵育 0–24 h（设时间梯度）

4. 洗涤：PBS 洗 3 次，4% 多聚甲醛固定 15 min

5. 染色：DAPI 染核、Phalloidin 染肌动蛋白

6. 成像 / 检测：共聚焦显微镜（定位）、流式细胞术（定量摄取率）

（二）体内示踪（小鼠模型）

1. 标记：DiR（近红外）或放射性标记外泌体

2. 给药：尾静脉 / 腹腔 / 瘤内注射（剂量：100–200 μg / 只）

3. 成像：小动物活体成像仪（IVIS），0、2、6、12、24 h 动态采集

4. 取材：处死小鼠，取主要器官（心、肝、脾、肺、肾、肿瘤），离体成像

5. 验证：免疫荧光 / WB 检测器官内外泌体标志物（CD63/CD81）